短程反硝化（PD）是指NO3--N還原到NO2--N的過(guò)程，相比于完全反硝化過(guò)程可節(jié)約60.10%的外加碳源。有研究表明，通過(guò)控制污泥類(lèi)型、碳源種類(lèi)、碳氮比（C/N值）、pH值、碳源投加方式等條件可以實(shí)現(xiàn)短程反硝化和NO2--N積累。畢春雪等、張星星等利用不同污泥快速啟動(dòng)了PD，NO2--N轉(zhuǎn)化率（NTR）分別在80%、70%左右。Ge等研究發(fā)現(xiàn)添加不同碳源時(shí)，添加葡萄糖碳源條件下亞硝酸鹽積累率最高，較高C/N值會(huì)獲得更高的NO2--N積累量。Gong等用乙酸鈉作為碳源時(shí)，發(fā)現(xiàn)在C/N值=1.4~3.5時(shí)NO2--N都能有效積累。Qian等發(fā)現(xiàn)當(dāng)系統(tǒng)pH值從5.0增至9.0時(shí)，反應(yīng)器中NTR逐漸升高，而且pH值=9.0時(shí)短程反硝化關(guān)鍵細(xì)菌Thauera的相對(duì)豐度最高。王淑瑩等研究表明，以污泥發(fā)酵液為碳源，分次投加和1次投加對(duì)短程反硝化系統(tǒng)中NTR的峰值影響不大，但分次投加更有利于NO2--N穩(wěn)定積累。在反硝化耦合厭氧氨氧化系統(tǒng)中，分次投加污泥發(fā)酵液不會(huì)降低厭氧氨氧化活性。Du等發(fā)現(xiàn)，在反硝化氨氧化（DEAMOX）系統(tǒng)中，總氮超過(guò)500mg/L時(shí)，分次投加碳源能明顯提升PD過(guò)程的NTR。

目前雖有少部分文獻(xiàn)報(bào)道了碳源投加方式對(duì)PD的影響，但這些研究多是采用短程反硝化ANAMMOX耦合工藝分析碳源投加方式對(duì)整體脫氮效果的影響，而碳源投加方式對(duì)PD中氮素轉(zhuǎn)化特性和轉(zhuǎn)化速率的影響鮮有研究。因此，筆者采用序批式反應(yīng)器（SBR）處理模擬硝酸鹽廢水，以乙酸鈉為碳源，探究在不同碳源投加方式下PD工藝的啟動(dòng)以及運(yùn)行性能的差異情況，并利用高通量測(cè)序技術(shù)分析不同條件下微生物群落變化，旨在為硝酸鹽廢水的處理提供理論支持。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置采用SBR反應(yīng)器，由有機(jī)玻璃制成，有效體積為3L，長(zhǎng)為11cm，寬為11cm，高為40cm，見(jiàn)圖1。在反應(yīng)器上方安裝JJ-1型懸臂式攪拌器，攪拌速度為200r/min，以保持反應(yīng)過(guò)程中的完全混合且溶解氧不超過(guò)0.2mg/L。使用哈希HQ30d溶解氧儀測(cè)定溶解氧，雷弗BT100L型蠕動(dòng)泵控制進(jìn)水和碳源投加，德力西2W040-10型電磁閥進(jìn)行排水。使用YX25L型溫控加熱盤(pán)控制反應(yīng)器內(nèi)溫度在24~25℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

SBR每天運(yùn)行2個(gè)周期，每周期進(jìn)水1.5L，排水比為50%。本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段，階段Ⅰ為反應(yīng)啟動(dòng)階段：厭氧攪拌360min（包括進(jìn)水2min），沉淀30min，排水5min；階段Ⅱ?yàn)樘荚赐都臃绞教骄侩A段：厭氧攪拌240min（包括進(jìn)水2min），沉淀30min，排水5min。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)水NO3--N為100mg/L，使用乙酸鈉溶液（COD為25g/L）提供反應(yīng)所需碳源，控制反應(yīng)起始C/N值為2。第Ⅰ階段（第1~10天）分4次投加碳源，即在t=0/1/2/3h分別投加3mL乙酸鈉溶液，旨在啟動(dòng)短程反硝化。第Ⅱ階段采用3種碳源投加方式，即1次投加方式（第11~28天，在t=0min時(shí)投加12mL乙酸鈉溶液）、3次投加方式（第29~47天，在t=0/30/60min分別投加4mL乙酸鈉溶液）、6次投加方式（第48~68天，在t=0/10/20/30/40/50min分別投加2mL乙酸鈉溶液）。3種投加方式各選取3個(gè)周期進(jìn)行單周期連續(xù)取樣。每天監(jiān)測(cè)SBR反應(yīng)器進(jìn)、出水的NO3--N、NO2--N、pH值。

1.3 接種污泥與實(shí)驗(yàn)進(jìn)水

接種污泥取自實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)成熟的全程自養(yǎng)脫氮污泥，接種后SBR反應(yīng)器內(nèi)混合液的MLVSS為1500mg/L，30d排泥1次。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)水為人工配制的模擬廢水，主要包括NaNO3、微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素、微量元素A及B溶液，pH值為7.5~8.5。

1.4 分析項(xiàng)目及方法

水樣首先經(jīng)過(guò)0.45μm納濾膜過(guò)濾，然后分別采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法、紫外分光光度法、PHS-3C型pH計(jì)、馬福爐灼燒重量法測(cè)定NO2--N、NO3--N、pH值、MLVSS；微生物群落結(jié)構(gòu)采用高通量基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析。

NTR、比轉(zhuǎn)化速率參考文獻(xiàn)進(jìn)行計(jì)算。

2、結(jié)果與分析

2.1 短程反硝化系統(tǒng)的啟動(dòng)

圖2反映了反應(yīng)器內(nèi)PD啟動(dòng)過(guò)程中NO3--N、NO2--N濃度及NTR變化情況。進(jìn)水NO3--N為100mg/L，乙酸鈉為唯一碳源，碳源分4次投入SBR反應(yīng)器中，PD系統(tǒng)經(jīng)過(guò)19個(gè)周期的馴化完成啟動(dòng)。啟動(dòng)可分為兩個(gè)階段：第1~9周期，PD活性增強(qiáng)階段；第10~19周期，PD活性穩(wěn)定階段。第1~9周期，反應(yīng)器出水NO3--N濃度從26.89mg/L降至12.39mg/L，NO2--N濃度從0.75mg/L增加到44.9mg/L，NTR從22.00%升至86.17%，此時(shí)認(rèn)為系統(tǒng)中PD性能逐漸增強(qiáng)。第10~19周期，反應(yīng)器出水NO3--N和NO2--N平均濃度為12.53mg/L和61.41mg/L，NO2--N高積累量得以維持，NTR平均為89.78%、最大為97.09%，說(shuō)明經(jīng)過(guò)19個(gè)周期的馴化，在SBR反應(yīng)器中成功啟動(dòng)了PD系統(tǒng)。

目前，大多數(shù)研究者啟動(dòng)PD采用一次性投加碳源的方法。畢春雪等在SBR反應(yīng)器中通過(guò)一次性投加乙酸鈉耗時(shí)21d啟動(dòng)了PD，張星星等采用3種不同的污泥源耗時(shí)9d啟動(dòng)了PD系統(tǒng)，且NTR均僅在70%左右。本實(shí)驗(yàn)采用的SBR反應(yīng)器僅經(jīng)過(guò)19個(gè)周期（10d）的運(yùn)行，NTR就達(dá)到89.78%，在短時(shí)間內(nèi)完成了高效穩(wěn)定PD系統(tǒng)的啟動(dòng)，因此可以認(rèn)為分次投加碳源有利于SBR反應(yīng)器中PD的啟動(dòng)。

2.2 碳源投加方式對(duì)短程反硝化的影響

2.2.1 氮素轉(zhuǎn)化特性

不同碳源投加方式對(duì)PD系統(tǒng)氮素轉(zhuǎn)化特性的影響如圖3所示。進(jìn)水NO3--N為100mg/L，一次性投加時(shí)，反應(yīng)器出水NO3--N、NO2--N平均濃度分別為17.18、49.24mg/L，NTR平均為75.10%、最大達(dá)到88.62%。前10d反應(yīng)器中NTR稍有波動(dòng)，后趨于穩(wěn)定。3次投加方式條件下，反應(yīng)器出水NO3--N、NO2--N平均濃度分別為12.28、58.9mg/L，NTR平均為81.55%，比一次性投加時(shí)高6.45%，NTR最大為88.72%，與一次性投加時(shí)相差不大，說(shuō)明3次投加時(shí)反應(yīng)器出水NTR波動(dòng)不大。6次投加方式條件下，反應(yīng)器出水NO3--N、NO2--N平均濃度分別7.33、60.92mg/L，NTR平均為86.55%、最高可達(dá)96.14%。

在不同的投加方式下，PD系統(tǒng)出水NO3--N、NO2--N濃度差異明顯。在其他運(yùn)行條件相同的情況下，隨著碳源投加次數(shù)的增多，SBR反應(yīng)器出水NO2--N濃度、NTR呈上升趨勢(shì)，NO3--N剩余量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明碳源投加次數(shù)增多有利于提升反應(yīng)器內(nèi)PD活性。碳源分6次投加可以在最大限度上促使NO3--N轉(zhuǎn)化為NO2--N，同時(shí)進(jìn)行完全反硝化的NO3--N比例下降，因此積累了高濃度的NO2--N。少量多次地投加碳源可使反應(yīng)器中的有機(jī)物濃度處于較低水平。在較低的C/N值條件下，硝酸鹽還原酶的活性大于亞硝酸鹽還原酶的活性，NO3--N優(yōu)先還原為NO2--N，使NO2--N得以積累。

2.2.2 典型周期轉(zhuǎn)化速率

圖4展示了不同碳源投加方式下SBR反應(yīng)器中PD典型周期內(nèi)NO3--N、NO2--N濃度及NTR變化情況。各條件下典型周期實(shí)驗(yàn)次數(shù)為3次。一次性投加時(shí)，在前60min，反應(yīng)器出水NO3--N濃度由64.63mg/L降至28.15mg/L，NO2--N濃度從12.68mg/L升至41.72mg/L，60min時(shí)NTR達(dá)到峰值80.09%。在后續(xù)180min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，NO2--N僅增加了3.94mg/L，NO3--N僅減少了9.45mg/L。3次投加時(shí)，反應(yīng)器出水氮素濃度變化主要在前90min內(nèi)，NO3--N在0~90min和90~240min的濃度分別下降了43.39、7.37mg/L，NO2--N則分別增加了30.83、4.21mg/L，但NTR峰值仍出現(xiàn)在60min時(shí)，為72.46%。6次投加時(shí)，在前60min完成了大部分NO2--N的積累，反應(yīng)器出水NO2--N增加了33.80mg/L，NO3--N減少了39.90mg/L，60min時(shí)NTR最大為84.50%。3種投加方式下反應(yīng)器內(nèi)NO3--N減少量均大于NO2--N積累量，二者差值越小，說(shuō)明反應(yīng)器內(nèi)NO2--N的還原量越少，NTR越高。

此外，3種投加條件下SBR反應(yīng)器出水NO3--N、NO2--N濃度及NTR變化趨勢(shì)基本相似。在反應(yīng)前期，反應(yīng)器出水NO3--N濃度隨著反應(yīng)的進(jìn)行而逐漸降低，NO2--N濃度不斷積累升高。這是因?yàn)樵诜磻?yīng)初期，硝酸鹽還原菌的底物NO3--N和碳源充足，硝酸鹽還原酶可結(jié)合的電子供體與受體增加，NO3--N可快速轉(zhuǎn)化為NO2--N。反應(yīng)一段時(shí)間后，反應(yīng)器中NO3--N、NO2--N濃度變化不大，是因?yàn)榉磻?yīng)后期NO3--N和碳源濃度較低，反應(yīng)變慢，NO3--N和NO2--N變化不明顯，因此二者濃度及NTR比較穩(wěn)定。有研究表明，當(dāng)C/N值大于3（超過(guò)了完全反硝化所需要的碳源量）時(shí)出水NO2--N濃度隨反應(yīng)的進(jìn)行而先增加后減少。而本實(shí)驗(yàn)中C/N值為2，且通過(guò)分次投加降低了反應(yīng)期間碳源濃度，使反應(yīng)器中不明顯發(fā)生完全反硝化，才成功在反應(yīng)后期穩(wěn)定積累NO2--N濃度。3種碳源投加方式下，反應(yīng)器中的NTR呈微弱的先上升后下降的趨勢(shì)，且均在60min時(shí)達(dá)到最大值。經(jīng)比較可知，6次投加方式下反應(yīng)器出水NO2--N濃度和NTR都達(dá)到最高水平。

在前4次取樣時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)器內(nèi)NO3--N減少量和NO2--N積累量與時(shí)間呈線(xiàn)性關(guān)系，R2>0.95。典型周期內(nèi)的PD反應(yīng)速率可由擬合后的二者濃度變化以及污泥濃度MLVSS來(lái)確定，結(jié)果如圖5所示。

在3種投加方式中，6次投加時(shí)NO3--N比還原速率、NO2--N比積累速率最大，分別為26.79、22.65mg/（g·h），3次投加方式的NO3--N比還原速率、NO2--N比積累速率最小，分別為19.42、13.95mg/（g·h）。此外，無(wú)論何種投加方式，NO3--N比還原速率遠(yuǎn)大于NO2--N比還原速率。一次性投加時(shí)，NO3--N比還原速率是NO2--N比還原速率的4.82倍，3次、6次投加時(shí)分別為3.55、6.47倍。6次投加方式的NO3--N比還原速率與NO2--N比還原速率相差最大，NO2--N得以更好地積累，與在該條件下PD系統(tǒng)具有較高的NTR相一致。由此可以認(rèn)為，NO3--N比還原速率大于NO2--N比還原速率是NO2--N積累的直接原因，這與王淑瑩等、Cao等的研究結(jié)果相似。

2.3 微生物群落分析

利用16SrDNA高通量測(cè)序進(jìn)一步了解不同運(yùn)行條件下反應(yīng)器中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況。seed取自反應(yīng)器運(yùn)行第1天（接種污泥）、R1取自反應(yīng)器運(yùn)行第16天（1次投加方式）、R3取自反應(yīng)器運(yùn)行第35天（3次投加方式）、R6取自反應(yīng)器運(yùn)行第57天（6次投加方式）。4個(gè)污泥樣品的Coverage值分別為98.80%、97.68%、99.60%、99.74%，有較高的樣本文庫(kù)覆蓋率，說(shuō)明本次測(cè)序有效。Shannon值用來(lái)表征微生物群落的多樣性，其數(shù)值越大，多樣性越高。seed、R1、R3、R6的Shannon值分別為5.69、8.02、6.19、7.10，說(shuō)明R1比其他樣品的物種多樣性要高，即seed、R3、R6中微生物的專(zhuān)一性更高，功能細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)更強(qiáng)。

SBR反應(yīng)器中各時(shí)期污泥樣品門(mén)水平、屬水平的微生物群落豐度見(jiàn)圖6。從圖6（a）可知，4個(gè)污泥樣品中分別檢測(cè)出9、11、18、15種已知菌門(mén)，有6種主要菌門(mén)（相對(duì)豐度>1.0%），分別為擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）和Patescibacteria菌門(mén)。按照豐度由高到低排序，seed中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)（84.08%）、厚壁菌門(mén)（14.86%）；R1中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)（70.50%）、厚壁菌門(mén)（25.60%）以及Patescibacteria菌門(mén)（1.59%）；R3中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)（38.49%）、變形菌門(mén)（32.73%）、綠彎菌門(mén)（22.35%）、浮霉菌門(mén)（4.28%）；R6中優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門(mén)（47.71%）、綠彎菌門(mén)（22.62%）、擬桿菌門(mén)（22.35%）、浮霉菌門(mén)（4.96%）�？梢园l(fā)現(xiàn)，R3、R6中出現(xiàn)了seed、R1中沒(méi)有的綠彎菌門(mén)，綠彎菌門(mén)是含有綠色素的兼性厭氧細(xì)菌，可以分解糖類(lèi)物質(zhì)并進(jìn)行脫氮。擬桿菌門(mén)的豐度逐漸降低，變形菌門(mén)的豐度逐漸升高，R6中變形菌門(mén)占47.71%，此豐度與已有文獻(xiàn)中活性污泥變形菌門(mén)的豐度相近。污水處理中常見(jiàn)的反硝化菌屬大多屬于變形菌門(mén)，變形菌門(mén)可以在降解有機(jī)物的同時(shí)脫氮除磷，因此，高豐度變形菌門(mén)是PD系統(tǒng)中高NTR的保證。

從圖6（b）可知，R3、R6新增了前兩個(gè)樣品中未檢測(cè)出的反硝化菌屬Thauera，相對(duì)豐度分別為14.29%、17.11%。Thauera是PD研究中實(shí)現(xiàn)NO2--N積累的功能菌屬。Du等的研究接種已馴化成功且穩(wěn)定運(yùn)行的反硝化污泥，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)后期Thauera是PD工藝中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為67.25%。而本實(shí)驗(yàn)接種污泥為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)成熟的全程自養(yǎng)脫氮污泥，反應(yīng)后期才出現(xiàn)Thauera，條件的優(yōu)化使與PD相關(guān)優(yōu)勢(shì)菌得到富集，這與6次投加時(shí)效果最優(yōu)的結(jié)論一致。

3、結(jié)論

①在常溫（24~25℃）下，當(dāng)進(jìn)水NO3--N為100mg/L、C/N值=2時(shí)，碳源分次投加，可以在短時(shí)間（10d）內(nèi)啟動(dòng)高效穩(wěn)定的PD系統(tǒng)。

②6次投加方式下SBR反應(yīng)器中PD運(yùn)行效能最好。6次投加方式下出水NO3--N、NO2--N平均濃度分別為7.33、60.92mg/L，NTR平均為86.55%，NO3--N比還原速率最大［26.79mg/（g·h）］，NO2--N比還原速率最�。�4.14mg/（g·h）］。

③碳源投加次數(shù)增多有利于提升SBR反應(yīng)器內(nèi)PD的活性，促進(jìn)反應(yīng)器出水NO2--N的積累，可為后續(xù)ANAMMOX脫氮提供充足的基質(zhì)。

④擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)是PD系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在3次投加和6次投加的污泥中出現(xiàn)的新菌屬Thauera是眾多已報(bào)道PD研究中實(shí)現(xiàn)NO2--N積累的功能菌屬，Thauera的富集能維持PD系統(tǒng)的穩(wěn)定。（來(lái)源：華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佛山市化爾銨生物科技有限公司，華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院）