隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展和人口增加，廚余垃圾數(shù)量日趨增多。在生活垃圾組成中，廚余垃圾占了四到六成。由于數(shù)量多，有機(jī)物質(zhì)含量高，廚余垃圾給環(huán)境帶來了巨大的污染，引起了中國政府的關(guān)注。廚余垃圾含水量高，有機(jī)物含量高，是理想的厭氧消化基質(zhì)。因此，國內(nèi)一些已建和在建的廚余垃圾處理項(xiàng)目，大多選擇以厭氧消化為主的工藝，即經(jīng)過篩選與除油之后進(jìn)行厭氧消化處理。厭氧消化過程中產(chǎn)生的殘?jiān)糜谏a(chǎn)有機(jī)肥，產(chǎn)生的生物燃?xì)獗换厥绽谩Ｒ虼�，厭氧消化是廚余垃圾資源化的主要途徑。厭氧消化包括4個(gè)過程：水解、酸化、產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷。在廚余垃圾水解酸化過程中會(huì)產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸（VFAs），主要是乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等。研究發(fā)現(xiàn)，廚余垃圾發(fā)酵液的VFAs產(chǎn)量（VFA/COD）高達(dá)221g/kg。并且，廚余垃圾發(fā)酵液中產(chǎn)生的乙酸含量最多，大約為總揮發(fā)酸含量的70%，其次是丁酸（20%）和丙酸（10%）。另外，水解酸化過程中還會(huì)將含氮物質(zhì)降解為蛋白質(zhì)，進(jìn)一步水解為氨。因此，廚余垃圾厭氧發(fā)酵后的沼液是含高氨氮和高揮發(fā)酸的廢水，一般需經(jīng)生化二級(jí)處理達(dá)標(biāo)后才能進(jìn)行排放。
目前，基于生物方法的硝化和反硝化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于廢水脫氮。反硝化脫氮的核心是電子傳遞和消耗有機(jī)物的過程，是硝酸鹽與碳物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)，以硝酸鹽為電子受體，有機(jī)物為電子供體。所以，在反硝化脫氮過程中需要足量的碳源，才能有效脫出總氮。在低C/N廢水中，往往要額外添加碳源，才能保證穩(wěn)定的脫氮效率。研究表明，廚余垃圾厭氧發(fā)酵液中的VFAs是一種優(yōu)良的低成本碳源。Ji和Chen發(fā)現(xiàn)，在短程硝化反硝化過程中，添加發(fā)酵液的總脫氮效率為98.7%，高于添加乙酸的去除率（79.2%）。Kim等將厭氧發(fā)酵液中的VFAs、乙醇和一種商業(yè)用有機(jī)碳作為碳源進(jìn)行反硝化測(cè)試，結(jié)果表明發(fā)酵液作為反硝化碳源的反應(yīng)速率和滯后長(zhǎng)度都是最有效的。
反硝化脫氮是由微生物主導(dǎo)的過程，研究表明添加發(fā)酵液為碳源的污泥樣品中Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Acidobacteria是主要的微生物門，Zoogloea和Thauera等是主要的功能微生物。目前，關(guān)于發(fā)酵液作為反硝化碳源的研究?jī)H從微生物群落組成方面進(jìn)行解析，而對(duì)其中涉及的功能基因變化及碳氮代謝等均還未深入研究。因此，我們采用序批式反應(yīng)器（SBR）反硝化工藝進(jìn)行長(zhǎng)期的脫氮試驗(yàn)，逐漸提高進(jìn)水硝酸鹽的濃度，添加混合揮發(fā)酸來模擬發(fā)酵液作為反硝化碳源，研究該系統(tǒng)的脫氮性能，以及反硝化功能微生物結(jié)構(gòu)和功能基因的變化，并通過宏基因組測(cè)序來揭示微生物的碳氮代謝過程。實(shí)際的脫氮表現(xiàn)和微生物分析結(jié)合起來將更全面地評(píng)價(jià)混合揮發(fā)酸是否是一種優(yōu)良的反硝化脫氮碳源；另外，微生物層面的研究也會(huì)為提高反硝化效率提供一些啟示。
1、材料與方法
1.1 SBR試驗(yàn)裝置與運(yùn)行
進(jìn)行長(zhǎng)期脫氮試驗(yàn)的裝置如圖1，反應(yīng)器的主體為厭氧血清瓶，總?cè)莘e為2L，有效容積為1.2L。該反應(yīng)器設(shè)有5根管道，用于進(jìn)水（碳源和硝酸鹽廢水分開進(jìn)樣）、出水，排氣和微生物取樣。反應(yīng)器采用3個(gè)蠕動(dòng)泵控制進(jìn)出水。采用小型磁力攪拌器（JOANLAB-MS5）來混勻液體和污泥。蠕動(dòng)泵和磁力攪拌器的運(yùn)行和關(guān)閉均由定時(shí)器控制。整個(gè)反應(yīng)裝置放置培養(yǎng)箱中并保持溫度30℃運(yùn)行。
反應(yīng)器執(zhí)行4h循環(huán)程序，反應(yīng)器的運(yùn)行周期包括10min出水（流速為40mL/min），14min的進(jìn)水（10min的合成的硝酸鹽廢水進(jìn)水，流速為40mL/min；4min的碳源進(jìn)水，流速為10mL/min），同時(shí)進(jìn)行40min攪拌（轉(zhuǎn)速為1800r/min），190min的靜置。每個(gè)周期進(jìn)水共400mL，出水400mL，維持有效體積為1.2L，水力停留時(shí)間為12h。初始反應(yīng)器均接種800mL的揮發(fā)性懸浮固體濃度（MLVSS）為2400mg/L的混合污泥，反應(yīng)器正式運(yùn)行后，保持污泥齡（SRT）為25d，MLVSS控制在4500-5500mg/L。
1.2 污泥的接種與試驗(yàn)階段廢水的組成
接種和馴化的污泥取自雙流嘉博文餐廚垃圾處理廠（成都）沼液生化處理A/O系統(tǒng)。取回到實(shí)驗(yàn)室后放于4℃冰箱保存，并且盡快混合接種到預(yù)培養(yǎng)桶中，加入培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至7左右。定期補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，馴化培養(yǎng)10d。
根據(jù)進(jìn)水硝酸鹽的濃度，反應(yīng)器正式運(yùn)行共分為6個(gè)階段，具體見表1.反應(yīng)器進(jìn)水的合成硝酸鹽廢水組分（1L）具體如下：50mgNa2HPO4，150mgKH2PO4，70mgCaCl2，400mgMgSO4，100mgNH4Cl，1mL微量元素I和0.1mL微量元素II。氮源由硝酸鈉提供，階段Ⅰ至階段Ⅵ添加的氮源分別為0.607、1.214、2.428、4.857、7.285、9.714g/L。由于反硝化會(huì)產(chǎn)生堿度，因此培養(yǎng)基最終pH調(diào)節(jié)至6.5左右。碳源的添加按照C/N=6.86，由乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉按照7:1:2的質(zhì)量比例混合提供。
1.3 批次試驗(yàn)方案
反應(yīng)器運(yùn)行至階段Ⅵ末期，取污泥進(jìn)行硝酸鹽反硝化潛勢(shì)的測(cè)定。首先配制不含有硝酸鹽和有機(jī)碳源的培養(yǎng)基。取500mL培養(yǎng)基加入1214.285mg硝酸鈉，并按照C/N為6.86加入1758.975mg乙酸鈉、1372mg丙酸鈉和1182.758mg丁酸鈉的混合物�；旌暇鶆蚝笸�3個(gè)厭氧瓶中各加入100mL碳源、硝酸鹽和培養(yǎng)基的混合液，并作好標(biāo)記。同時(shí)，從反應(yīng)器中取污泥混合液40mL，離心取沉淀。用培養(yǎng)基（未添加硝酸鹽和有機(jī)碳源）清洗3次后，加入40mL培養(yǎng)基，混合均勻，用于接種。將污泥混合液接種至上述3個(gè)厭氧瓶中，每瓶接種5mL�；旌暇鶆颍髌咳�1mL液體，用于測(cè)定初始硝酸鹽濃度。最后，3個(gè)厭氧瓶各曝N25min，蓋上塞子，置于搖床30℃培養(yǎng)，每1h取液體樣品一次，共取5次，測(cè)硝酸鹽濃度。
1.4 試驗(yàn)分析與測(cè)定方法
長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)過程中，每天連續(xù)監(jiān)測(cè)出水的NO3--N和NO2--N濃度。出水NO3--N和NO2--N濃度通過紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。脫氮效率（NRE）通過以下公式來計(jì)算：
式中，CNO3-N-Inf為進(jìn)水硝酸鹽的濃度（mg/L），CNO3-N-Eff為出水硝酸鹽的濃度（mg/L），CNO2-N-Eff為出水亞硝酸鹽的濃度（mg/L）。
出水中VFAs的測(cè)定使用配備FID柱火焰電離檢測(cè)器（FID）和毛細(xì)管柱（DB-FFAP，USA，30m×0.25mm×0.25mm）的氣相色譜儀（Agilent6890N）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：使用一系列梯度的已知濃度的乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、異戊酸、正戊酸的混合樣品，測(cè)定其峰面積，建立濃度和峰面積的線性關(guān)系。測(cè)定前，樣品需要經(jīng)過預(yù)處理，首先取2mL樣品離心（1000r/min，10min），取上清液1mL于新的離心管中，加入100μL甲酸，離心（1000r/min，10min），用注射器取上清液過0.45μm濾膜至新的離心管中待測(cè)，每次的進(jìn)樣量為1μL。
1.5 污泥樣品的微生物分析
1.5.1 微生物樣品的取樣和DNA提取
分別在每個(gè)階段開始運(yùn)行后的第五天和最后一天取微生物樣品，共12個(gè)樣品，放置-40℃冰箱保存。
稱取濕重為0.25g左右的污泥，使用土壤DNA提取試劑盒（TIANGEN，China）進(jìn)行DNA的提取。DNA濃度和純度的鑒定采用NanoDrop（NANODROP2000，ThermoScientific，USA）。然后將提取的DNA部分稀釋至10ng/μL，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）。
1.5.2 PCR擴(kuò)增、測(cè)序和下機(jī)數(shù)據(jù)處理
使用515F（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和909R（CCCCGYCAATTCMTTTRAGT）引物來擴(kuò)增16SrRNA基因的V4-V5的高變區(qū)。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱3min，然后94℃變性40s，56℃退火60s，72℃加熱60s，共30個(gè)循環(huán)，最終72℃下延伸10min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增的長(zhǎng)度約為500bp，然后對(duì)目的條帶用膠回收試劑盒DNAGelExtractionKit（擎科生物公司）回收產(chǎn)物。文庫構(gòu)建使用TruSeq®DNAPCR-FreeSamplePreparationKit建庫試劑盒，Qubit和qPCR定量構(gòu)建好文庫，文庫合格后，采用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。擴(kuò)增子測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)，需要進(jìn)行拼接、質(zhì)量過濾、OTU聚類、嵌合體去除和重抽樣等步驟，每個(gè)樣品測(cè)序深度如表2，并以41427條序列進(jìn)行重抽樣（resampling）。最后對(duì)生成的擴(kuò)增序列變體（Ampliconsequencevariants，ASV）進(jìn)行豐度、α和β多樣性指數(shù)等分析以及后續(xù)分析。原始測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳NCBI，登錄號(hào)為PRJNA936989。
1.5.3 熒光定量PCR（qPCR）
使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）來定量各個(gè)階段樣品的nosZ基因的拷貝數(shù)。功能基因擴(kuò)增使用的引物是nosZ-F和nosZ-R。反應(yīng)的總體系為10μL，包括5μL2×TSINGKE®MasterqPCRMix（SYBRGreenI），上游和下游引物各0.5μL，1.5μLDNA模板（10ng/μL）和2.5μL的ddH2O。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，使用CFX384實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）進(jìn)行擴(kuò)增。將所有DNA樣品等體積混合后擴(kuò)增，取其產(chǎn)物作為模板DNA（稀釋到10ng/μL），然后進(jìn)行梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。擴(kuò)增效率在90%以上，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2大于0.99，且陰性對(duì)照不出現(xiàn)熒光信號(hào)。最后，根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA濃度（換算為拷貝數(shù)）與Ct值的關(guān)系算出樣品的基因拷貝數(shù)（copies/MLSS，g-1）。
1.5.4 宏基因組測(cè)序
用于宏基因組測(cè)序的DNA與微生物群落分析的相同。首先，評(píng)估DNA質(zhì)量，包括DNA濃度、降解和污染情況�；蚪MDNA樣品通過超聲處理片段化至350bp的大小。NEBNext®ULtra™DNALibraryPrepKit（NEB，美國）用于生成測(cè)序文庫。在Illumina平臺(tái)（Illumina，USA）上對(duì)DNA文庫進(jìn)行測(cè)序，并生成150bp的配對(duì)端讀數(shù)。使用fastp（版本0.20.0）篩選原始數(shù)據(jù)以獲取cleandata。然后將優(yōu)化的序列用于剪接組裝（Megahi，1.1.2版）和基因預(yù)測(cè)（MeteGene）。所有樣本的預(yù)測(cè)基因序列均采用CD-HIT（版本4.6.1）進(jìn)行聚類，并構(gòu)建非冗余基因集。Blastp（版本2.3.0）被用作將非冗余基因序列與NCBINR數(shù)據(jù)庫（e≤10-5）進(jìn)行比對(duì)和分類注釋。根據(jù)京都基因和基因組百科全書（KEGG，版本2.3.0版）數(shù)據(jù)庫對(duì)基因進(jìn)行注釋。
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
所有微生物的分析與作圖均采用Rversion4.2.0.使用“ggplot2”包進(jìn)行作圖。使用“vegan”包完成基于BrayCurtis距離的主坐標(biāo)分析（principlecoordinateanalysis，PCoA）和影響微生物群落的環(huán)境因子的冗余分析（RDA），以表示微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。用Manteltest來分析功能基因nosZ的拷貝數(shù)與功能微生物的關(guān)系。其他圖片均使用Origin2018繪制。
2、結(jié)果與討論
2.1 反應(yīng)器長(zhǎng)期運(yùn)行和批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果
反應(yīng)器一共運(yùn)行了92d，長(zhǎng)期運(yùn)行過程中進(jìn)水硝酸鹽濃度、出水硝酸鹽濃度、出水亞硝酸鹽濃度、進(jìn)水硝酸鹽容積負(fù)荷以及脫氮效率的變化情況如圖2a。在階段Ⅰ，進(jìn)水硝酸鹽濃度（以N計(jì)，下同）為100mg/L時(shí)，出水硝酸鹽濃度很低，亞硝酸鹽濃度為零，脫氮效率高達(dá)99%。進(jìn)水硝酸鹽為200mg/L時(shí)，系統(tǒng)出現(xiàn)了一些波動(dòng)，出水硝酸鹽濃度最高達(dá)7.66mg/L，出水亞硝酸鹽積累濃度達(dá)47.82mg/L，脫氮效率為72%。在階段Ⅲ-階段Ⅳ，系統(tǒng)表現(xiàn)趨于穩(wěn)定，脫氮效率基本維持在95%以上。階段Ⅴ后期和階段Ⅵ的前幾天，系統(tǒng)再次出現(xiàn)了波動(dòng)，脫氮效率降低到80%，但是在經(jīng)過短暫幾天的波動(dòng)后，系統(tǒng)脫氮效率恢復(fù)到99%以上。王弄潮等的研究表明總氮負(fù)荷波動(dòng)會(huì)影響厭氧氨氧化與反硝化協(xié)同的脫氮系統(tǒng)的穩(wěn)定性，總氮負(fù)荷波動(dòng)達(dá)到2.10kgm-3d-1時(shí)氮的去除會(huì)降低50%，而在我們的研究中，在負(fù)荷為3200mgL-1d-1時(shí)系統(tǒng)只出現(xiàn)了短暫幾天的波動(dòng)后出水指標(biāo)合格，這表明使用混合揮發(fā)酸的反硝化系統(tǒng)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。
如圖2b所示，取反應(yīng)器長(zhǎng)期運(yùn)行最高負(fù)荷的污泥來進(jìn)行批次實(shí)驗(yàn)，研究在長(zhǎng)期馴化下硝酸鹽的還原能力。在0h，硝酸鹽濃度為393mg/L，3h剩余的濃度為180mg/L，最終還剩余72mg/L的硝酸鹽。硝酸鹽氮的去除分為兩個(gè)階段，即快速下降階段（0-2h）和慢速去除階段（2-5h），分別對(duì)0-2h和2-5h的硝酸鹽濃度變化進(jìn)行了線性擬合，0-2h擬合的方程式為y=-111.94687x+393.77842；2-5h擬合的方程式為y=-36.38292x+247.96864（y為硝酸鹽濃度，x為時(shí)間）。從兩個(gè)時(shí)間段的擬合優(yōu)度判定系數(shù)R2分別為0.98和0.96來看，擬合的直線可以代表實(shí)際硝酸鹽的去除速率。從擬合直線的變化來看，快速下降階段的硝酸鹽去除速率為111.95mgL-1h-1N，而慢速去除階段的硝酸鹽去除速率為36.38mgL-1h-1N。Fernandez-Nava等的研究認(rèn)為在混合碳源的反硝化中，微生物首先利用容易降解的碳源快速處理硝酸鹽氮，之后降解利用復(fù)雜碳源來去除硝酸鹽氮，這個(gè)過程則比較緩慢，在本研究中可能與添加的不同有機(jī)酸的代謝快慢有關(guān)。
2.2 微生物群落分析
2.2.1 微生物群落的α和β多樣性
α多樣性是指一個(gè)群落內(nèi)的物種數(shù)量及相對(duì)豐度。本研究選擇采用Shannon指數(shù)來分析細(xì)菌群落的α多樣性隨進(jìn)水硝酸鹽負(fù)荷的變化情況。從圖3a可以看到，污泥樣品的Shannon指數(shù)值隨著硝氮負(fù)荷的增加而呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。微生物群落的α多樣性是從低負(fù)荷就開始減少，Shannon指數(shù)值從開始的5.3（M-100-1）迅速減少到2.6（M-200-1），到階段V后期降低到1.12.這表明該系統(tǒng)內(nèi)的微生物種類隨著硝酸鹽濃度的增加而減少。
β多樣性指數(shù)用以衡量群落的物種多樣性沿著環(huán)境梯度變化的速率或群落間的多樣性。本研究使用基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（PcoA）來研究微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。如圖3b，PCoA圖的PCoA1和PCoA2軸分別解釋了61.56%和2.19%的群落的變化。該系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)在硝氮負(fù)荷增加過程中發(fā)生了兩次明顯的變化，第一次周轉(zhuǎn)是在進(jìn)水硝酸鹽濃度為200mg/L時(shí)，第二次周轉(zhuǎn)發(fā)生在進(jìn)水硝酸鹽濃度為800mg/L，總體呈現(xiàn)出了一個(gè)“U”型的周轉(zhuǎn)。Lu等認(rèn)為長(zhǎng)久的NO3--N注入對(duì)細(xì)菌具有選擇性，導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在該研究中兩個(gè)變化的主要因素是碳源和進(jìn)水硝酸濃度，由于加入的碳源始終是過量的，所以排除碳源不足對(duì)微生物的影響，即認(rèn)為硝氮負(fù)荷是微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要影響因子。
2.2.2 微生物的群落組成
為了進(jìn)一步明確以混合揮發(fā)酸為碳源的反硝化系統(tǒng)內(nèi)微生物物種組成以及豐度變化情況，對(duì)12個(gè)污泥樣品的微生物群落在門和屬水平上進(jìn)行了類別和豐度的分析。污泥樣品在門水平上（豐度為前11的門）的微生物組成及相對(duì)豐度如圖4a。變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes）是該系統(tǒng)中主要的微生物門。變形菌門的豐度從31.8%（M-100-1）增加到95.8%（M-1600-2）。擬桿菌門的相對(duì)豐度在2.5%-41%，厚壁菌門的相對(duì)豐度較低，范圍為0.61%-12.1%。變形菌門和擬桿菌門一直被認(rèn)為是反硝化過程中最常見的反硝化微生物，該門含有各種類型的反硝化微生物，這與其他文獻(xiàn)的研究結(jié)果是一致的。與之相反，在該系統(tǒng)中有一些門的微生物，如綠彎菌門（Chloroflexi）和脫硫桿菌門（Desulfobacterota）等豐度隨著硝氮負(fù)荷的增加而逐漸降低。如綠彎菌門從12.7%（M100-1）減少到0.089%（M-1600-2）。脫硫桿菌門微生物豐度在從3.7%（M-100-1）下降到0.41%（M-1600-2）。根據(jù)之前的研究，在反硝化脫氮中添加食物發(fā)酵液后，綠彎菌門的豐度增加，認(rèn)為該門下的一些成員在厭氧條件下可以利用揮發(fā)酸，但本研究中隨著進(jìn)水硝酸鹽濃度的升高，該門不再是優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌門，這說明綠彎菌門的微生物不能很好地適應(yīng)高氮環(huán)境。
進(jìn)一步對(duì)各樣品在屬水平上（豐度高的前20個(gè)屬）的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4b所示。首先，紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）是系統(tǒng)所有樣品中最核心的微生物。紅環(huán)菌科的豐度在初始樣品中占比為7.8%（M-100-1），但到階段Ⅱ（M-200-2）時(shí)，其占比達(dá)到了67.8%，并且在階段Ⅵ（M1600-2）占比達(dá)到了最高的87.1%。此前的報(bào)道揭示紅環(huán)菌科可以利用醇類、有機(jī)酸和氨基酸等碳源還原硝酸鹽。并且紅環(huán)菌科也被證明在稻田土壤中可以在厭氧條件下以乙酸鹽為底物還原一些物質(zhì)，如Fe（Ⅲ）、U（Ⅵ）、硝酸鹽和高氯酸鹽。還有研究揭示了紅環(huán)菌科的成員，如Zoogloea、Azoarcus和陶厄氏菌（Thauera）都是主要的反硝化細(xì)菌，且在反硝化反應(yīng)器中添加一定劑量的乙醇或乙酸鹽會(huì)有利于這些細(xì)菌的生長(zhǎng)。另外，陶厄氏菌和Blvii28_wastewatersludge_group也是系統(tǒng)中的兩種核心微生物。陶厄氏菌豐度的變化范圍為0.7%-27.2%。陶厄氏菌作為紅環(huán)菌科的成員，是污水處理廠的涉及反硝化的核心微生物，可以利用乙酸鈉和丙酸鈉作為碳源進(jìn)行反硝化。陶厄氏菌也是一種可以利用丁酸鹽的硝酸鹽還原菌，有研究使用MAR-FISH研究了探針定義的群體的底物攝取偏好，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陶厄氏菌吸收了部分丁酸鹽和戊酸鹽。Blvii28_wastewater-sludge_group的豐度范圍為0.17%-41%，在階段Ⅰ-Ⅲ豐度很低，但在階段Ⅳ-Ⅵ豐度增加，說明其可能是高氮中一種重要的反硝化者。在之前的研究中，Blvii28_wastewater-sludge_group常常在降解復(fù)雜化合物方面有重要作用，在丁酸鹽氧化產(chǎn)甲烷系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)該種微生物與乙酸鹽含量呈正相關(guān)。
另外，系統(tǒng)中還有一些微生物在初始樣品（M-100-1）中具有一定豐度，然而，隨著反應(yīng)器運(yùn)行，它們的豐度逐漸下降，在最終污泥樣品（M-1600-2）中豐度幾乎為0.所涉及的微生物菌屬有SJA-28（0.014%-24.3%）、unculturedProlixibacteraceae（0-4.9%）、OLB13（0.0024%-3.8%）等。研究報(bào)道，長(zhǎng)桿菌（Prolixibacteraceae）可以在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中使用（半）纖維素類復(fù)合物和發(fā)酵糖類，兩種異養(yǎng)細(xì)菌（SJA-28和OLB13）可以利用有機(jī)碳源進(jìn)行反硝化。然而，他們?cè)谙到y(tǒng)中豐度下降表明這些微生物可能不適應(yīng)高氮的環(huán)境。
總之，紅環(huán)菌科、陶厄氏菌、Blvii28_wastewater-sludgegroup是系統(tǒng)中主要的功能微生物，他們?cè)谙到y(tǒng)中高度富集，表明微生物的功能集中性增加了。不同的微生物對(duì)硝酸鹽濃度的變化表現(xiàn)出不同的響應(yīng)方式，表明硝酸鹽濃度對(duì)微生物群落組成具有高度選擇性。
2.2.3 影響微生物群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子
主要的功能微生物與環(huán)境變量的RDA如圖5所示，RDA的前兩軸解釋了總變異的93.8%。硝酸鹽負(fù)荷是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的最重要的環(huán)境因子，其次是pH。其中，紅環(huán)菌科和Blvii28_wastewatersludge-group與硝酸鹽負(fù)荷和pH呈正相關(guān)，陶厄氏菌與硝酸鹽負(fù)荷和pH呈負(fù)相關(guān)。這說明隨著負(fù)荷的提高，作為主要的功能微生物，紅環(huán)菌科和Blvii28_wastewater-sludge-group比陶厄氏菌更能抵抗高硝酸鹽環(huán)境。
2.2.4 功能基因nosZ的變化
N2O是主要的溫室氣體之一，會(huì)導(dǎo)致全球氣溫升高。反硝化中，這一步驟（N2O→N2）是由nosZ基因編碼的N2O還原酶來催化的。因此，本研究通過定量污泥樣品中的nosZ基因，來研究添加混合揮發(fā)酸作為碳源的反硝化過程中N2O的排放情況。如圖6a所示，該系統(tǒng)的nosZ基因拷貝數(shù)（copies/MLSS）變化范圍為2.48×107-6.85×1010g-1.系統(tǒng)的nosZ基因拷貝數(shù)總體隨著硝氮負(fù)荷的增加而增加。然而，拷貝數(shù)存在著3次顯著下降，分別發(fā)生在樣品100-2、200-2和1600-1中，這正好與長(zhǎng)期反應(yīng)器試驗(yàn)中系統(tǒng)發(fā)生波動(dòng)的時(shí)期一致。這說明微生物受到環(huán)境的影響時(shí)其豐度會(huì)相應(yīng)減少，從而影響其脫氮效率。
進(jìn)一步，采用Manteltest分析nosZ基因拷貝數(shù)與主要功能微生物的相關(guān)性（主要功能微生物紅環(huán)菌科、陶厄氏菌和Blvii28_wastewater-sludge-group豐度之和）。如圖6b所示，該系統(tǒng)的nosZ基因拷貝數(shù)與功能微生物的相關(guān)性R值為0.88，P值為0.00019，說明該系統(tǒng)的nosZ基因拷貝數(shù)與功能微生物之間具有顯著的正相關(guān)性，表明系統(tǒng)中加入的硝酸鹽可被這3種功能微生物代謝的終產(chǎn)物可能是N2。
2.3 宏基因組分析
樣品（M-1600-2）被用于宏基因組測(cè)序，共獲得12.02G的原始數(shù)據(jù)。利用KEGG代謝數(shù)據(jù)庫對(duì)整個(gè)代謝途徑進(jìn)行分析。圖7a顯示了kegg3級(jí)通路上富集的一些功能。豐度排名前6的功能有代謝通路（metabolicpathways，ko01100）、次級(jí)代謝物的生物合成（biosynthesisofsecondarymetabolites，ko01110）、多樣環(huán)境中的微生物代謝（microbialmetabolismindiverseenvironment，ko01120）、雙組分系統(tǒng)（twocomponentsystem，ko02020）、輔助因子的生物合成（biosynthesisofcofactors，ko01240）和碳代謝（carbonmetabolism，ko01200）。代謝通路（ko01100）相對(duì)豐度為16.6%，顯著高于其他通路。另外，氮代謝（nitrogenmetabolism，ko00910）通路的相對(duì)豐富為0.71%。
進(jìn)一步對(duì)碳、氮代謝過程中涉及的模塊進(jìn)行分析。如圖7b所示，氮代謝中涉及的模塊主要有氮固定（M00175）、硝酸鹽同化還原（M00530）、硝酸鹽異化還原（M00531）、硝化（M00528）、反硝化（M00529）和全程硝化（M00804），他們的相對(duì)豐度分別為0.0065%、0.60%、0.20%、0.00026%、0.6822%和0.28%�？梢钥闯�，該系統(tǒng)中的氮代謝主要集中在反硝化反應(yīng)和硝酸鹽同化還原。M00009（2.6%）是TCA循環(huán)的模塊，代表著乙酸的代謝過程。M00741（0.22%）和M00013（0.20%）兩個(gè)模塊是參與丙酸鹽代謝的兩個(gè)模塊，M00087（1.28%）、M00088（0.75%）和M00027（0.13%）是丁酸鹽代謝相關(guān)的模塊。由此可以看出，在該系統(tǒng)更多的是發(fā)生乙酸鹽代謝，然后是丁酸鹽代謝。從圖7d也可以看出，出水中剩余最多的是乙酸，然后是丙酸，也就是說相對(duì)于丙酸，丁酸更優(yōu)先被利用了。研究表明相對(duì)于丁酸和丙酸，乙酸更優(yōu)先被利用。乙酸被直接氧化并轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，丁酸和丙酸同樣都是代謝為乙酸才被微生物利用，但是丁酸經(jīng)過β氧化為乙酸，丙酸則是合成丁酸發(fā)生歧化反應(yīng)或者先生成丙酰COA轉(zhuǎn)化成乙酰，代謝過程更復(fù)雜。本研究選擇的C/N為6.86，低負(fù)荷的出水中并未檢測(cè)到剩余的揮發(fā)酸，排除機(jī)器靈敏度低造成的誤差，1200和1600mg/L負(fù)荷的高有機(jī)酸殘留率的原因可能有兩個(gè)：首先，本來添加的碳源是過量的，負(fù)荷越高剩余越多。另外，在低負(fù)荷時(shí)存在的微生物種類較多，除了反硝化者，還有一些非反硝化者，它們可能也利用有機(jī)酸滿足生長(zhǎng)，隨著進(jìn)水硝酸鹽負(fù)荷的增加，非反硝化者和部分反硝化者被淘汰掉，用于生長(zhǎng)所需要的碳源也會(huì)減少。
氮代謝過程是由多種酶參與的，圖7c展示了涉及反硝化的功能基因的相對(duì)豐度。在反硝化過程中，編碼關(guān)鍵酶的基因主要有narG和narA（NO3-→NO2-）、nirS和nirK（NO2-→N2O）、norB（N2O→NO）和nosZ（NO→N2）。該系統(tǒng)具有最高的narG基因豐度，其次是nosZ基因。nosZ（31.86%）基因在反硝化基因中所占的豐度顯著高于nirS（5.37%）、nirk（0.18%）和norB（11.35%）基因，表明添加混合揮發(fā)酸在減少N2O排放方面可能有重要意義。另外可以看到，同樣作為亞硝酸鹽還原的基因，nirS的豐度顯著高于nirK，這表明nirS型微生物在亞硝酸鹽還原中可能具有更重要的作用。也有其他研究表明在大多數(shù)廢水處理系統(tǒng)中nirS基因相對(duì)豐度高于nirK基因。
3、結(jié)論
添加混合有機(jī)酸作為反硝化碳源的系統(tǒng)具有高效穩(wěn)定的脫氮效率，最大的反硝化速率為111.95mgL-1h-1。微生物的α多樣性顯著降低，微生物群落均朝一定方向周轉(zhuǎn)，并且功能微生物高度富集，說明系統(tǒng)功能集中性增強(qiáng)。另外，系統(tǒng)在長(zhǎng)期馴化中富集了高豐度的反硝化代謝模塊，且高度富集了反硝化功能基因nosZ，這對(duì)于減少溫室氣體排放可能有著重要的意義。綜上結(jié)果來看，混合有機(jī)酸作為反硝化脫氮的碳源具有一定的可行性，系統(tǒng)內(nèi)功能微生物高度富集，脫氮性能穩(wěn)定，出水指標(biāo)合格,還可以節(jié)約成本，可以考慮用于實(shí)際的污水處理。但本研究也存在一些局限性，只是用人工合成的混合有機(jī)酸來代替食物發(fā)酵液中的揮發(fā)酸，而實(shí)際的揮發(fā)酸成分復(fù)雜，對(duì)微生物可能存在其他方面的影響。另外缺少對(duì)氣體數(shù)據(jù)（N2）的監(jiān)測(cè)，故關(guān)于使用混合揮發(fā)酸作為碳源在可以減少N2O排放方面還缺少有力證據(jù)。后續(xù)可以將功能微生物紅環(huán)菌科分離出來，明確其功能；并使用真實(shí)的食物發(fā)酵液作為碳源，完善監(jiān)測(cè)指標(biāo)，根據(jù)處理效果明確食物發(fā)酵液作為反硝化碳源的優(yōu)勢(shì)。（來源：福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，中國科學(xué)院成都生物研究所，核工業(yè)西南勘察設(shè)計(jì)研究院有限公司）
